Gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano il DNA a singolo e doppio filamento. Ogni enzima di restrizione ha una sequenza nucleotidica specifica, chiamata un sito di restrizione, che riconosce e taglia. Gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per il sequenziamento del DNA, l'analisi delle mutazioni e la clonazione e l'amplificazione del DNA. Gli scienziati usano gli enzimi di restrizione per inserire geni di interesse in vettori di espressione, molecole di DNA che possono replicarsi separatamente dal DNA cromosomico. Il vettore contenente il gene di interesse può quindi essere introdotto in un ceppo batterico per l'espressione e la caratterizzazione delle proteine.
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Passaggio 1
Identifica i siti degli enzimi di restrizione sul tuo vettore osservando una mappa di restrizione. La mappa di restrizione ti dirà quali enzimi taglieranno il tuo vettore e dove.
Passaggio 2
Scegliere un enzima di restrizione che abbia anche un sito presente sull'REPLACEo del gene, osservando la sequenza dell'REPLACEo. Assicurati che il sito di restrizione sia in una posizione sul tuo REPLACEo al di fuori del gene di interesse, in modo da non perdere nessuna parte del gene.
Passaggio 3
Assicurarsi che non vi siano duplicati del sito di restrizione in nessun punto del proprio REPLACEo o vettore genico. Ciò causerà tagli multipli nel tuo DNA e ti fornirà dati fuorvianti.
Passaggio 4
Provare a scegliere gli enzimi di restrizione che tagliano con estremità appiccicose, piuttosto che estremità smussate. Le estremità appiccicose si verificano quando l'enzima taglia il DNA a doppio filamento in modo sfalsato, lasciando una singola sporgenza a trefoli che facilita l'attacco con un taglio dell'REPLACEo nella direzione opposta. Le estremità smussate si verificano quando il DNA a doppio filamento viene tagliato in modo uniforme e questi sono più difficili da attaccare.
Passaggio 5
Scegliere un enzima di restrizione diverso per entrambe le estremità dell'REPLACEo per assicurarsi che sia inserito nel vettore con l'orientamento corretto e per garantire che il vettore non si riattacchi.
Passaggio 6
Provare a scegliere due enzimi di restrizione che funzionano bene con lo stesso sistema tampone e la stessa temperatura. Se questo non è possibile, esegui ogni digestione separatamente.
Cose che ti servono
- Sequenza di REPLACEo genico
- Mappa di restrizione per vettore di scelta
- Elenco di enzimi di restrizione e relativi siti di taglio
Suggerimenti
- Alcuni programmi Web sono stati sviluppati per identificare siti di restrizione su una sequenza di DNA rapidamente. Uno di questi programmi è del New England BioLabs.
